|
اینجا همه چی درهمه
از بودن در این وب سایت لذت ببرید دوستان عزیز
|
|||||||||||||||
|
اصل مقاله بررسی الگوی الکتروفورزی، فعالیت آنزیمهای ریبونوکلئازی و مطالعه ژن ریبونوکلئاز S در خامه‌های خود و دگرتلقیح رقمهای زراعی 'Bravo cool water mix' و'Bravo purple star' گیاه اطلسی حکیمه علومی1 و 2،*، فرخنده رضانژاد2 و حسین علی ساسان2 1کرمان، پردیس دانش ماهان،مرکز بین‌المللی علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، پژوهشکده علوم محیطی،گروه اکولوژی 2 کرمان، دانشگاه شهید باهنر، دانشکده علوم، بخش زیست شناسی چکیده درگیاه اطلسی، خودناسازگاری توسط گلیکوپروتئینهای خامه‌ای کنترل می‌شود. این گلیکوپروتئینها دارای فعالیت ریبونوکلئازی می‌باشند. در این مطالعه، پس از گرده‌افشانی مادگی رقم زراعی خودناسازگار Bravo purple star و رقم زراعی خودسازگار Bravo cool water mix اطلسی با گرده‌های خودی و غیرخودی، فعالیت ریبونوکلئازهای خامه به روش اسپکتروفتومتری و ایزوآنزیمهای ریبونوکلئازهای خامه به روش PAGE مورد بررسی قرار گرفت. همچنین میزان بیان ژن ریبونوکلئاز S در خامه خود و دگرتلقیح این رقمها بررسی شد. به دلیل اهمیت نوع آلل S در بروز برهمکنشهای ناسازگار، آلل S هر رقم نیز مورد شناسایی قرار گرفت. فعالیت ریبونوکلئازهای کل در خامه خودتلقیح رقم Bravo purple star در مقایسه با سایر نمونه‌ها بیشتر بود. الگوی الکتروفورزی ریبونوکلئازها در خامه‌های دو رقم مورد مطالعه تفاوت نشان داد. فعالیت باند ریبونوکلئاز RNase 3، تنها در خامه خودتلقیح و با شدت کمتر در خامه دگرتلقیح رقم Bravo purple star، مشاهده شد. نتایج نشان داد که ژن S-RNase، در خامه‌های خود و دگرتلقیح هر دو رقم زراعی خودناسازگار و خودسازگار و با شدت بیشتر در خامه خودتلقیح رقم خودناسازگار بیان می‌شود. مقایسه توالی به دست آمده با سایر توالیهای موجود، نشان دهنده 100 درصد شباهت بین قطعه تکثیر شده در رقم Bravo purple star با آلل S3-RNase گیاه Petunia hybrida زیرگونه inflata بود. همچنین، بین توالی بازهای قطعه تکثیر شده رقم Bravo cool water mix با آلل S1-RNase گیاه Petunia hybrida 100درصد شباهت وجود داشت. مقدمه در گیاهان شیوه‌های زیادی برای ممانعت از خودباروری وجود دارد. یکی از این روشها، خودناسازگاری می‌باشد. امروزه خودناسازگاری به صورت مهمترین و گسترده‌ترین مکانیسم برای تشویق برون‌زادی (Out-breeding) در گیاهان گل‌دار تعریف می‌شود. خودناسازگاری یک سیستم بازشناسی گرده-مادگی، براساس ژنتیک می‌باشد که خود و دگرباروری را بین افراد با تیپ ناسازگاری مشابه ممانعت می‌کند (10). در خودناسازگاری گامتوفیتی خامه‌ای (GSI) که در تیرههای سیب زمینی، نخود، رز و میمون دیده شده، اگر هاپلوتیپ گرده با یکی از هاپلوتیپ‌های مادگی جور شود، گرده به عنوان گرده خودی شناخته شده و رشد لوله آن در خامه متوقف می‌شود. گرده‌ای که هاپلوتیپ متفاوت از هاپلوتیپ مادگی را داشته باشد به عنوان گرده غیرخودی شناخته شده و لوله آن اجازه رشد درون مادگی را پیدا می‌کند. مطالعات مولکولی متعددی برای جواب به این سوالات که چطور گرده غیرخودی و خودی توسط مادگی تشخیص داده می‌شود و بازشناسی گرده خودی چگونه منجر به مهار رشد لوله گرده می‌شود، انجام گرفته است (11). مطالعات نشان داده است که محصول خامه‌ای لوکوس خودناسازگاری (لوکوس S) در سیستم GSI خامه‌ای، ریبونوکلئازهای ویژه S هستند. محصول آللهای S، گلیکوپروتئین با ویژگی ریبونوکلئازی بوده و تجزیه RNA گرده مرتبط با آلل S، پس از گرده‌افشانی ناسازگار رخ می‌دهد. مشخص شده که پروتئینهای S، برای رد گرده خودی در خامه ضروری و کافی می‌باشند (12). مطالعات نشان داده است که این گلیکوپروتئین در بخش خامه‌ای یعنی جایی‌که مهار رشد لوله گرده انجام میگیرد، با غلظتهای بالاتر بیان می‌شود. مقایسه cDNA کدکننده آللهای S در Nicotiana alata نشان‌دهنده تنها 65 درصد شباهت آمینواسیدها در بین بخشهای مختلف آلل بود (18). توالی پروتئینهای S در هاپلوتیپ‌های متفاوت گیاهان خودناسازگار، به طور غیرمعمولی متنوع بوده و شباهت آمینواسیدها بین پروتئینهای S بین 38 درصد تا 98 درصد متغیر می‌باشد (23). این گلیکوپروتئین با وزن مولکولی حدود 32 کیلودالتون، دارای حداقل دو بخش اصلی شامل ناحیه حفاظت شده (C: Conserved region) و نواحی بسیار متغیر (HV: Hyper variable region) است. هرگونه برهمکنش بین این پروتئین و گرده یا لوله گرده به احتمال با دخالت سطح پروتئین می‌باشد (18 و 25). تنوع بین آللها در کل توالی گلیکوپروتئین مشاهده می‌شود اما این تنوع در نواحی بسیار متغیر (HV) که بین پنج توالی حفاظت شده (C1-C5) قرارگرفته‌اند، تمرکز بیشتری نشان می‌دهد. به نظر می‌رسد که دو ناحیه HVa و HVb که تنوع آللی بالایی دارند و آبدوست می‌باشند، در سطح مولکول قرار گرفته و به طور مستقیم در بازشناسی ریبونوکلئاز S با بخش اختصاصی گرده درگیر باشند (17). فعالیت ریبونوکلئازی مرتبط با گلیکوپروتئینهای S در N. alata، حدود 80 درصد فعالیت ریبونوکلئازی عصاره‌های خامه را نشان می‌دهد (20). همچنین مشخص شده است که تجزیه RNA گرده وابسته به آلل S، پس از ورود ریبونوکلئاز به لوله گرده و بازشناسی آن در شرایط "در زیوه"، رخ می‌دهد. ریبونوکلئاز تنها زمانی فعال است که جزء اختصاصی آن با دانه گرده جفت شود (25). ریبونوکلئاز S در سویههای خودسازگار (SC: Self-compatible) نیز بیان می‌شود. دیده شده است گونه Licopersicum peruvianym دارای افراد خودسازگار و خودناسازگار می‌باشد. نتایج نشان داده است که پروتئین مرتبط با آلل S، در افراد خودسازگار وجود دارد. این پروتئین یک ریبونوکلئاز S غیرفعال بوده که باقیمانده هیستیدینی را در جایگزینی آن با آرژنین، در محل فعال از دست داده است، اما احتمال دارد که تغییراتی غیر از جایگزینی هیستیدین مسئول نقص عملکرد SI می‌باشند (16). رقمهای متعددی از P. hybrida برای اهداف تحقیقاتی و تجاری به وجود آمده است. از تلقیح رقمهای سازگار با رقمهای ناسازگار برای مطالعه اساس ژنتیکی خودناسازگاری استفاده می‌شود. مانند سایر گونه‌های تیره بادمجان که تاکنون مطالعه شدهاند، خودناسازگاری در گیاه P. hybrida گامتوفیتی با یک لوکوس S چندآللی می‌باشد (4 و 26). درطول نمو جوانه گل، گلیکوپروتئینهای S در نیمه بالایی خامه تجمع می‌یابند و به مقادیر بسیار کم در تخمدان وجود دارند. (8 و 24). توالی کامل ژن ریبونوکلئاز S در گیاه Petunia x hybrida دارای 3221 جفت باز بوده که 1905 جفت باز در توالی Flanking انتهای 5' و 504 جفت باز در توالی حاشیه‌ای انتهای 3' می‌باشد. یک اینترون 118 جفت بازی نیز بین بازهای 2168 و 2285 توالی DNA ریبونوکلئاز S قرار گرفته است (4). مقایسه توالی cDNA ریبونوکلئاز S بین گیاه اطلسی و توتون، نشان داده است که این پروتئین با حدود 122 آمینواسید و وزن مولکولی بین 27 تا 33 کیلودالتون دارای یک توالی نشانه (Signal peptide) و یک توالی حفاظت شده با 15 آمینواسید در ناحیه انتهایی N (N terminus) می‌باشد. پروتئین ریبونوکلئاز S درگیاه اطلسی دارای 4 توالی حفاظت شده دیگر بوده که به طور تقریبی در 16 درصد کل آمینواسیدها با گیاه توتون مشابه هستند. شباهت توالی پروتئینهای S در محل هشت باقیمانده سیستئینی و 5 توالی حفاظت شده می‌باشد (20). پروتئین ریبونوکلئاز S دارای دو ناحیه متغیر بوده که در واکنش بازشناسی گرده دخالت دارند که این نواحی متغیر HVa و HVb بین توالیهای حفاظت شده C2 و C3 قرار گرفته‌اند. در تمام گونه‌های این تیره یک محل گلیکوزیله شدن ثابت در پروتئین ریبونوکلئاز S وجود دارد (5). تعداد کل آللهای S شناخته شده در P. hybridaدر حدود 10 آلل می‌باشد، در حالی‌که ممکن است آللهای جدیدی نیز در حال تشکیل باشد (24). در این مطالعه میزان فعالیت ریبونوکلئازهای خامه در رقم خودناسازگار Bravo purple star و رقم خودسازگار Bravo cool water mix گیاه اطلسی (P. hybrida) که در ایران کشت می‌شوند پس از خودتلقیحی و دگرتلقیحی در خامه‌ها مقایسه شد. همچنین بیان ژن ریبونوکلئاز S در این خامه مطالعه و آلل S در این رقمها مورد شناسایی قرار گرفت. مواد و روشها دانة رقم زراعی خودناسازگار Bravo purple star و رقم زراعی خودسازگار Bravo cool water mix گیاه P. hybrida از شرکت Syngenta seeds B.V تهیه و در شرایط مزرعه‌ای کشت داده شدند. پس از گلدهی، گلها مورد مطالعه قرارگرفتند. شرایط گرده‌افشانی: پس از انجام آزمون زیست پذیری دانه‌های گرده (1) کلالة 30 گل از هر رقم زراعی با گردة بساکهای تازه شکفته همان گل گرده‌افشانی شدند. همچنین در هر رقم 30 گل نیز با استفاده از گردة پایه‌های سایر رقمها مورد گرده‌افشانی قرارگرفتند. برای جلوگیری از گرده‌افشانی طبیعی در گلهایی که به طور مصنوعی گرده‌افشانی شده بودند، بخش انتهایی گلبرگها با نخ بسته شد. مطالعه فعالیت ریبونوکلئازها در خامه: استخراج آنزیم: مقدار 100 میلی گرم از نمونه‌ها (شامل خامه، گلبرگ و کاسبرگ از رقمهای زراعی خودسازگار و خودناسازگار خودتلقیح و دگرتلقیح) پس از پودر شدن در ازت مایع، در 100 میکرولیتر بافر استخراج حل شدند. این بافر شامل سیتریک اسید 150 میلی مولار و PMSF 1/0 میلی مولار (3=pH) می‌باشد (2). این بافر نوارهای بیشتری از RNase را نسبت به بافرهای با pH خنثی نشان می‌دهد (29). پس از سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد، عصاره تا زمان استفاده در دمای 70- درجه سانتی گراد نگهداری گردید (29). از روش اسپکتروفتومتری برای تعیین فعالیت ریبونوکلئازی استفاده شد. مقدار 20 میکرولیتر از آنزیم استخراج شده به 200 میکرولیتر بافر هضم شامل K3PO4 1/0 مولار با 7pH= ، و KCl 05/0 مولار که حاوی 4 میلی گرم در لیتر RNA مخمر Torulopsis utilis (torula yeast RNA, Sigma, USA) بود، اضافه شد. در لوله آزمایش کنترل که به عنوان نمونه مرجع استفاده می‌شود، واکنش بی‌درنگ با اضافه کردن µL55 تری کلرواستیک اسید 20 درصد سرد شده در یخ، متوقف شد و سپس نمونه در یخ قرار گرفت. سایر نمونه‌ها برای انجام واکنش به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد قرارگرفتند. سپس به منظور متوقف ساختن واکنش، نمونه‌ها همراه با نمونه کنترل به مدت 10 دقیقه در یخ قرارگرفتند و بعد در 13000 دور برای 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. تفاضل جذب نمونه‌ها نسبت به نمونه کنترل (که واکنش آن بی‌درنگ پس از اضافه نمودن عصاره، با اضافه نمودن TCA سرد وگذاشتن در یخ متوقف شده بود) در nm260 محاسبه شد. فعالیت ریبونوکلئاز به صورت افزایش در جذب در nm260 نمونه‌ها نسبت به کنترل، پس از یک دقیقه انجام واکنش به ازای میلی‌گرم پروتئین موجود در بافر موجود در 200 میکرولیتر عصاره محاسبه و به صورت واحد آنزیم در میلی‌گرم پروتئین بیان شد (19). مطالعه الگوی ایزوآنزیمهای ریبونوکلئاز به روش PAGE (6): از ژل تفکیک کننده 5/12 درصد (حاوی4/2 میلی‌گرم بر میلیلیتر RNA مخمر Torulosis utilis، 9=pH) و ژل متراکم کننده 75/3 درصد (8/6=pH) در دستگاه الکتروفورز عمودی (Universal, USA، از شرکت BioRad) و محلول پایه بافر الکترود (Glycin M92/1، Tris M25/0، 3/8=pH) حاوی mg/ml3/0RNA مخمر ، جهت جداسازی پروتئینها ومطالعه الگوی ایزوآنزیمهای ریبونوکلئاز استفاده شد. برای برقراری جریان الکتریسیته از منبع تغذیه (BioRad, PowerPacTM Universal, USA) و شدت جریان 80 میلی آمپر استفاده گردید. معادل حجم نمونه (20 میکرولیتر)، بافر نمونه (گلیسرول 10 درصد و برموفنل بلو 025/0 درصد در بافر Tris-HCl با 8/6pH=) به هر عصاره پروتئینی قبل از انجام الکتروفورز اضافه گردید. پس از تزریق 40 میکرولیتر پروتئین به درون چاهک، جریان الکتریکی به مخزن پرشده از بافر الکترود وصل شد و سپس جریان الکتریکی برقرار شد. بعد از اتمام الکتروفورز، ژلها در محلول Tris-HCl 1/0 مولار به مدت 50 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفته و پس از آن در Tris-HCl 01/0 مولار به مدت 10 دقیقه شسته شدند. سپس با آبی تولوئیدن O 2/0 درصد (w/v) در Tris-HCl 01/0 مولار به مدت 10 دقیقه قرارگرفتند. ژلها با دو بار شستشو در Tris-HCl 01/0 مولار به مدت 10 و 20 دقیقه رنگبری شدند. بعد از شستشوی نهایی در گلیسرول 10 درصد (v/v) در Tris-HCl 01/0 مولار، نوارهای آنزیمی قابل ظاهر شدند (3). استخراج RNA کل: خامه‌های گرده‌افشانی شده با گرده خودی و غیرخودی رقمهای Bravo cool water mix و Bravo purple star، 48 ساعت پس از گرده‌افشانی از گل جدا شدند. RNA کل بافت خامه با استفاده از کیت استخراج RNA (QIAGEN, RNeasy Plant Mini Kit, Korea) و طبق روش ذکرشده درکیت، استخراج گردید. ساخت DNA مکمل و انجام واکنشهای زنجیره‌ای پلیمراز (PCR): برای ساختن DNA مکمل از 2 میکروگرم RNA به دست آمده از هر نمونه و آغازگر oligo-dt، بر اساس روش Kato و Mukai (2004) (14) در طی واکنشهای زنجیره‌ای پلیمراز استفاده شد. تکثیر cDNA و واکنش PCR، با استفاده از 2 میکرولیتر آغازگرهای Forward و Reverse (به ترتیب طراحی شده از توالی حفاظت شده شماره 1 و 3 پروتئین S-RNase که توالی آنها در زیر آمده است)، 5 میکرولیتر cDNA و کیت PCR (PCR Premix, BioNEER, Korea) انجام شد شدت باند به دست آمده روی ژل آگارز (آگارز 1 درصد در بافر TBE، pH=8) با استفاده از نرم‌افزار TotalLab (v 1.10) مورد مقایسه قرار گرفت. تعیین توالی: قطعه تکثیر شده ژن ریبونوکلئاز S در واکنشهای PCR، به منظور انجام واکنشهای تخلیص و تعیین توالی، به شرکت MilleGen (Labége, France) ارسال گردید. تعیین توالی توسط دستگاه تعیین توالی Applied Biosystems مدل 3730XL و با استفاده از روش دی‌داکسی (Termination chain dedoxy) انجام شد. سپس به منظور تشخیص آلل S-RNase، ردیف بازهای به دست آمده در بانک ژنی GeneBank توسط نرم‌افزار Blast مورد مطالعه قرار گرفت. بررسیهای آماری: داده‌های مربوط به شدت بیان ریبونوکلئاز S (به دست آمده از نرم‌افزار v1.10 TotalLab,) برای مقایسه شدت نوار DNA از واکنشهای PCR، توسط آزمون T و در سطح معنی‌داری 95 درصد مورد مقایسه قرار گرفت. نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel 2003 رسم شد. نتایج فعالیت ریبونوکلئازها: نوع گرده‌افشانی بر فعالیت ریبونوکلئازهای خامه مؤثر بود. فعالیت این آنزیم در خامه خودتلقیح هر دو رقم در مقایسه با خامه دگرتلقیح این رقمهای زراعی بیشتر بود. آنزیم RNase در خامه خودتلقیح رقم زراعی Bravo purple star فعالیت بیشتری نسبت به رقم زراعی Bravo cool water mix نشان داد (شکل 1). شکل 1- فعالیت ریبونوکلئاز(U. mg-1Protein) در خامه خودتلقیح و دگرتلقیح رقمهای زراعی Bravo purple star و Bravo cool water mix گیاه اطلسی. داده‌ها شامل میانگین± خطای استاندارد از 3 تکرار می‌باشند. شکل 2- الگوی ایزوآنزیمی فعالیت ریبونوکلئاز در خامه خودتلقیح و دگرتلقیح، گلبرگ و کاسبرگ (به ترتیب الف، ب، ج و د) رقم زراعی Bravo purple star و خامه خود و دگرتلقیح (به ترتیب ه، و، ز و ح) رقم زراعی Bravo cool water mix. فعالیت بالای باند ریبونوکلئازی RNase 2 و RNase 3 در خامه خودتلقیح رقم Bravo purple star مشاهده شد. ریبونوکلئاز RNase 4 نیز در خامه خود و دگرتلقیح رقم Bravo cool water mix دارای باند قوی‌تری بود. مطالعه فعالیت ریبونوکئازی در ژل، نشان دهنده فعالیت بالای باندهای ریبونوکلئازی RNase2 و RNase3 در خامه خودتلقیح رقم Bravo purple star بود. فعالیت این باندهای ریبونوکلئازی در خامه خود و دگرتلقیح رقم Bravo cool water mix مشاهده نشد. با توجه به الگوی الکتروفورزی پروتئین و استاندارد آن، نوار ریبونوکلئازی S با گستردگی بالا (RNase3) در محدوده وزن مولکولی حدود 27 تا 30 کیلودالتون واقع شده است. ریبونوکلئاز فعال دیگری (RNase4) نیز در خامه خود و دگرتلقیح رقم Bravo cool water mix دارای باند قوی‌تری بود (شکل 2). بیان ریبونوکلئاز S: RNA کل از خامه رقمهای خود و دگرتلقیح با استفاده از کیت استخراج RNA Qiagen استخراج شد. مقدار 2 میکروگرم بر میکرولیتر RNA به منظور انجام واکنشهای ساخت DNA مکمل و PCR استفاده شد. با استفاده از آغازگر Forward PC1 و آغازگر Reverse PC3، قطعه‌ای با حدود 300 جفت باز تکثیر شد. بیان S-RNase در خامه‌های خودتلقیح و دگرتلقیح در هر دو رقم مشاهده شد، بنابراین ژن مسئول در واکنشهای خودناسازگاری، در رقم خودسازگار Bravo cool water mix نیز بیان می‌شود (شکل 3). توالیریبونوکلئاز S: قطعه تکثیر شده حاصل از انجام واکنشهای PCR، توسط شرکت Millegen فرانسه با استفاده از دستگاه DNA sequencer مدل ABI، تعیین توالی شد. به منظور تشخیص آلل S، توالی به دست آمده در بانک ژنی توسط نرم افزار Blast مورد مطالعه قرار گرفت. شکل 3- تکثیر DNA مکمل در واکنش PCR. الف وب: به ترتیب خامه دگرتلقیح و خودتلقیح رقم زراعی Bravo purple star ج و د: به ترتیب خامه دگرتلقیح و خودتلقیح رقم زراعی Bravo cool water mix. M مارکر وزن مولکولی RNA در ژل و M' طرح مارکر RNA از شرکت Fermentas می‌باشد. مقایسه توالی با سایر توالیهای موجود، نشان دهنده 100 درصد شباهت بین قطعه تکثیر شده در رقم Bravo purple star با آلل S3-RNase گیاه Petunia hybrida زیرگونه inflata بود. بین توالی بازهای قطعه تکثیر شده رقم Bravo cool water mix با آلل S1-RNase گیاه Petunia hybrida 100 درصد شباهت وجود داشت. بحث و نتیجهگیری میزان فعالیت ریبونوکلئاز: نتایج نشان داده است که فعالیت S-RNase تا 80 درصد فعالیت ریبونوکلئازهای خامه را شامل می‌شود. بنابراین می‌توان با اندازه‌گیری میزان فعالیت کل ریبونوکلئازها، میزان فعالیت S-RNase را تخمین زد (29). در این پژوهش، فعالیت ریبونوکلئازها در خامه گرده‌افشانی شده هر دو رقم زراعی مورد مطالعه مشاهده شد. فعالیت ریبونوکلئاز در خامه خودتلقیح هردو رقم در مقایسه با خامه دگرتلقیح، بیشتر بود. اما در رقم خودناسازگار Bravo purple star، خودتلقیحی منجر به افزایش فعالیت ریبونوکلئاز به میزان بیشتری در مقایسه با انواع خودتلقیح رقم خودسازگار Bravo cool water mix گردید. نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر، گزارش سایر محققین درباره فعالیت ریبونوکلئاز S در مادگی گیاهان Prunis salicina (31)، P. avium (28)، Solanum chacoense (22) و Witheringia solanacea (29) را تأیید می‌کند. این نتایج نشان می‌دهد که ریبونوکلئاز S در خامه گیاهان خودسازگار و خودناسازگار وجود داشته اما فعالیت آن در گونه‌های خودناسازگار پس از خودتلقیحی بسیار بیشتر از گونه‌های خودسازگار می‌باشد. محققین دریافتند که سویههای خودناسازگار گونه‌های Nicotiana alata و Licopersicum peruvianum فعالیت ریبونوکلئازی بیشتری در مقایسه با سویههای خودسازگار دارند. پیشنهاد شده است که فعالیت ریبونوکلئاز مادگی در رقمهای خودناسازگار منجر به مهار رویش لوله‌های گرده ناسازگار در آنها می‌شود (16). در این مطالعه باند ایزوآنزیمی متفاوتی بین دو رقم مشاهده شد. خامه دگرتلقیح رقم زراعی خودناسازگار Bravo purple star دارای باند آنزیمی RNase 3 بود که این باند آنزیمی در خامه رقم زراعی Bravo cool water mix مشاهده نشد. Yen و Green (1991) گزارش کردند که فعالیت ریبونوکلئازها در اندامهای مختلف، متفاوت بوده و در خامه بیشترین باند فعالیت ریبونوکلئاز متعلق به S-RNase می‌باشد (32). بنابراین به نظر می‌رسد که باند RNase3 مشاهده شده در خامه رقم زراعی Bravo purple star در مطالعه فعالیت ریبونوکلئاز در سیستم PAGE، متعلق به ریبونوکلئاز S باشد. Singh و همکاران (1991) دریافتند که غیر از ریبونوکلئاز S، ریبونوکلئازهای دیگری در مادگی گیاهان خودناسازگار Petunia inflate وجود داشته که محدوده وزن پروتئینی آنها (در مطالعه با الگوی الکتروفورزی پروتئین) با مادگی گیاهان خودسازگار تفاوت دارد و بنابراین، به احتمال فعالیت ریبونوکلئازی قوی (RNase4) که در خامه‌های خودسازگار مشاهده می‌شود، ریبونوکلئاز S نمی‌باشد (27). با توجه به نتایج سایر محققین، به نظر می‌رسد باند RNase 4 متعلق به ریبونوکلئازهای غیر از لوکوس S می‌باشد که تنها در خامه رقم خودسازگار Bravo cool water mix فعال بود. Kondo و همکاران (2002) در مطالعه سویههای خودسازگار و خودناسازگار L. esculentum، علاوه بر باند ریبونوکلئاز فعال در محدوده 30 کیلودالتون در سو‌یه خودناسازگار، باند ریبونوکلئازی فعالی را در محدوده 22 کیلودالتون در سو‌یه خودسازگار تشخیص دادند. این محققین بیان کردند که باند آنزیمی KDa22 متعلق به ریبونوکلئازهای غیر S (Non-S RNase) و متعلق به ریبونوکلئازهای LE و LX می‌باشد (16). Kao و Tsukamoto (2004) بیان می‌کنند فعالیت ریبونوکلئازی موجود در خامه سویههای خودسازگار به دلیل فعالیت ریبونوکلئازهای یادگار (Relic ribonucleases) یا شبه S بوده که دارای تنوع آللی نیستند. پیشنهاد شده است این ریبونوکلئازها نقشی در برهمکنشهای خودناسازگاری ندارند، اما اهمیت فیزیولوژیکی آنها در خامه هنوز مشخص نشده است (13). مطالعات دیگری نشان داده است که فعالیت ریبونوکلئازی در خامه خودسازگار گونه inflata Petunia ، قابل مقایسه با خامه‌های خودناسازگار بوده ولی در رقم خودناسازگار، باندی با فعالیت آنزیمی قوی‌تری مشاهده می‌شود (27). پیشنهاد شده است که در تلقیح سازگار (غیرخودی) رقم خودناسازگار، مولکول ریبونوکلئاز ممکن است غیرفعال شده و یا اینکه طوری تغییر کند که فعالیت بازدارندگی خود روی رشد لوله گرده را از دست بدهد (15). بنابراین کاهش فعالیت ریبونوکلئاز S در خامه دگرتلقیح رقم خودناسازگار Bravo purple star در نتیجه غیرفعال شدن آن بوده است که در الگوی الکتروفورزی آن نیز شدت فعالیت کمتری در باند آنزیمی RNase3 مشاهده می‌شود. Tomimoto و همکاران (1996) بیان کردند که احتمالاً، نقص در یکی از فرآورده‌های آلل S در رقمهای سازگار Prunus communis، منجر به عدم فعالیت طبیعی ریبونوکلئاز S و در نتیجه خودسازگار بودن این رقمها شده است (30). بسیاری از مطالعات نیز بیان می‌کند که به دلیل جهش در ژنوم ریبونوکلئاز S در رقمهای خودسازگار، فعالیت آن در لوله گرده مهار شده است (8، 15 و 24). مکانیسم احتمالی غیرفعال شدن ریبونوکلئاز S در رقمهای خودناسازگار پس از تلقیح با گرده غیرخودی، شامل تجزیه S-RNase از طریق مسیر وابسته به یوبیکوتینی شدن می‌باشد، اما در گرده‌افشانی ناسازگار، ریبونوکلئاز S یوبیکوتینی نمی‌شود و در نتیجه فعال بوده و منجر به مهار رشد لوله گرده می‌شود (21). ریبونوکلئاز فعال می‌تواند منجر به تجزیه RNA لوله گرده خودی شده، در حالی که در لوله‌های گرده غیرخودی این واکنش به میزان بسیار کمتری مشاهده می‌شود. بنابراین، S-RNaseها به عنوان سلول‌کشهای قوی عمل کرده، مرگ لوله گرده را باعث می‌شوند. S-RNaseها می‌توانند موجب تجزیه rRNA و یا mRNA آنزیمهای ضروری برای ادامه رشد لوله گرده شوند. نتایج نشان داده است که تأثیر ریبونوکلئاز S از طریق تجزیه rRNA و mRNA می‌باشد (9). بیان S-RNase : S-RNase در خامه‌های خود و دگر تلقیح در هر دو رقم بیان شد، بنابراین ژن مسئول در واکنشهای خودناسازگاری، در رقم زراعی خودسازگار Bravo cool water mix نیز بیان می‌شود. با توجه به بیان این ژن در خامه خودتلقیح رقم زراعی خودسازگار Bravo cool water mix، به نظر می‌رسد این فرضیه که در رقم خودسازگار ریبونوکلئاز S بیان نمی‌شود، نادرست باشد. بنابراین، این احتمال وجود دارد که از ترجمه این ژن در رقم خودسازگار Bravo cool water mix در خامه ممانعت شده است، یا اینکه فعالیت پروتئین آن در خامه تلقیح شده (همان طور که در الگوی الکتروفورزی فعالیت آنزیم نیز مشاهده می‌شود)، مهار شده است. تصور می‌شود مهار آنزیم به احتمال از طریق غیرفعال شدن آن (به عنوان مثال از طریق یوبی‌کوتینی‌شدن) و یا به دلیل تغییر در ساختار ژنتیکی آن باشد. در مطالعات قبلی نیز گزارش شده است که ریبونوکلئاز S در گونه‌های خودسازگار و خودناسازگار تیرههای Solanaceae، Rosaceae و Scrophulariceae بیان می‌شود (12). Kao و Tsukamoto (2004) دریافتند که گونه خودسازگار L. peruvianum دارای یک S-RNase با محل کاتالیتیک غیرفعال بوده که باقیمانده هیستیدنی در یکی از محلهای فعال آن با آرژنین جایگزین شده است (12، 13). این جایگزینی منجر به غیرفعال شدن ریبونوکلئاز S می‌شود. از آنجایی که فعالیت این ریبونوکلئاز برای رد گرده ناسازگار ضروری است (12)، بنابراین فرآیند تجزیه RNA لوله گرده و در نتیجه فرآیند رد گرده در خامه سازگار انجام نمی‌گیرد (13). Katoh و همکاران (2002) نیز در مطالعه گیاه Malus domestica و Pyrus pyrifolia، وجود ریبونوکلئازهای S با جرمهای مولکولی متفاوت را در خامه رقمهای خودسازگار وخودناسازگار این گیاه گزارش کردند. آنها بیان کردند که ریبونوکلئاز S در رقم خودسازگار، یک ریبونوکلئاز غیرفعال بوده که غیرفعال بودن آن به احتمال به دلیل وجود زنجیره‌های گلیکانی متفاوت درمقایسه با ریبونوکلئاز S رقم خودناسازگار و یا در اثر ایجاد جهش در ژنوم ریبونوکلئاز می‌باشد (15). گزارشاتی وجود دارد که بیان می‌کند میزان بیان ریبونوکلئاز S در خامه‌های گیاهان خودسازگار کمتر از مقدار آن در خامه گیاهان خودناسازگار است (15). Qin و همکاران (2006) گزارش کردند که رشد لوله گرده خودی در سو‌یه خودسازگار گونه Solanum chacoense به دلیل جهش در اجزاء آلل S (شامل محصولات گرده یا خامه) بوده و نه به دلیل تغییر در میزان بیان ژن (22). پیشنهاد شده است که جهش در اجزاء آلل S گرده (ژنوم F-box)، منجر به رشد لوله گرده خودی در گونه‌های خودسازگار و حتی خودسازگار پراکنده (Sporadic self-incompatible species) می‌شود. بنابراین پروتئینهای اجزاء آلل S گرده جهش یافته، ریبونوکلئازهای S خودی را مشابه ریبونوکلئاز غیرخودی تشخیص داده، آن را غیرفعال می‌کنند و بنابراین رشد لوله گرده خودی به طور کامل انجام میگیرد (28). آلل ریبونوکلئاز S رقمهای زراعی Bravo cool water mix و Bravo purple star: نواحی بسیار متغیر پروتئین ریبونوکلئاز S بین نواحی دوم و سوم حفاظت شده قرار گرفته که دارای اجزای ضروری برای بازشناسی گرده می‌باشد، بنابراین استفاده از این بخش از توالی ریبونوکلئاز، به شناسایی آلل آن کمک می‌کند (22). Dodds و همکاران (1993) اندازه توالی بین آغازگرهای PC1 و PC3 را حدود 340 نوکلئوتید روی cDNA، گزارش کردند (7). در مطالعات قبلی نیز تعیین توالی غیرکامل(جزئی) (Partial sequencing) به منظور تشخیص نوع آلل ریبونوکلئاز S، با استفاده از توالی حفاظت شده پروتئین ریبونوکلئاز در گیاهان Nicotiana alata (7)، Solanum chacoense(22)، Prunus lannesiana (14) و Prunus avium (28) انجام گرفته است. بخشی از توالی DNA مکمل S-RNase شامل قطعه تکثیر شده بین آغازگرهای توالی حفاظت شده 1و 3 پروتئین S-RNase، به منظور تشخیص آلل ریبونوکلئاز مورد تعیین توالی قرار گرفتند. نتایج تعیین توالی نشان داد که ریبونوکلئاز S رقم Bravo purple star به طور 100 درصد با آلل S3-RNase گیاه Petunia hybrida شباهت دارد. تعیین توالی ناکامل (جزئی) ریبونوکلئاز S در رقم Bravo cool water mix، نیز با آلل S1 گیاه Petunia hybrida 100 درصد شباهت داشت. با استفاده از این اطلاعات می‌توان از پرایمرهای اختصاصی این آللها برای شناسایی توالی کامل ریبونوکلئاز S در این گیاهان، مطالعه توالی بازهای ژن ریبونوکلئاز S و مقایسه با آلل ریبونوکلئاز S در سایر رقمهای این گونه یا گونه‌های دیگر استفاده نمود. Clarke و همکاران (1995) توالی کامل ژن ریبونوکلئاز S را در گیاه Petunia x hybrida شناسایی کرده و بیان کردند که این ژن دارای 3221 جفت باز بوده که 1905 جفت باز در توالی مجاور (پیرامون) انتهای 5' و 504 جفت باز در توالی مجاور انتهای 3' می‌باشد. یک اینترون 118 جفت بازی نیز بین بازهای 2168 و 2285 توالی DNA ریبونوکلئاز S قرار گرفته است. پروتئین S1-RNase دارای پپتید نشانه (Signal peptide) با 22 آمینواسید بوده که خروج پروتئین به فضای خارج سلولی بافت گذر خامه را باعث می‌شود . اصل مقاله بررسی شرایط اکسیدی ایجاد شده در باکتری گرمادوست Thermus GH5بعد از شوک سرمایی معصومه یوسفینژاد1، حسین نادریمنش*،2 و خسرو خواجه1 1تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوشیمی 2تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوفیزیک چکیده گرمادوستها موجوداتی هستند که در دمای بالاتر از 45 درجه رشد می‌کنند و از نظر احتیاجات حیاتی به ترکیبات گوگردی احیاء و محیطهای گرم نیاز دارند. اکثر ارگانیزمهای گرمادوست از خاکها و آبهای حاوی عنصر گوگردی جداسازی شدهاند که در اثر فعالیتهای طبیعی زمین گرم هستند. این ارگانیزمها دارای آنزیمها و مسیرهای متابولیکی خاصی هستند که کاربرد وسیعی در بیوتکنولوژی دارند، بنابراین مطالعه بر روی چگونگی زندگی این موجودات ضروری بهنظر می‌رسد. در این مطالعه با استفاده از روش پروتئومیکس محتوای پروتئینهای باکتری ترموس GH5 (جداسازی شده از چشمه‌های آب گرم زیست بوم ایران (اردبیل در شمال غربی ایران) در شرایط طبیعی (رشد در دمای 75 درجه سانتی گراد) و شوک سرمایی (رشد در دمای 45 درجه سانتی گراد) مورد مقایسه قرار گرفت. با توجه به افزایش بیان پروتئینهای آنتی اکسیدانت و درگیر در سم زدایی اکسیداتیو، پدیدار شدن شرایط اکسیداتیو حدود 8 ساعت پس از شوک سرمایی مشخص گردید. با توجه به کاربرد آنزیمهای آنتیاکسیدانت به عنوان نشانگرهای درمانی و مارکر پروتئینهای و پایداری پروتئینهای ارگانیزمهای ترموفیل، شناسایی و استخراج پروتئینهای شناسایی شده در این مطالعه ضروری به نظر می رسد. مقدمه باکتریهای هوازی انرژی مورد نیاز خود را از طریق فسفریلاسیون اکسیداتیو به دست می‌آورند، بنابراین حضور اکسیژن برای حیات آنها ضروری به نظر می‌رسد. فرآیند تولید انرژی و فسفریلاسیون اکسیداتیو توأم با احیاء مولکول اکسیژن و تبدیل آن به آب است. این فرآیند با انتقال 4 الکترون در زنجیره انتقال الکترون همراه می‌باشد. این جریان الکترونی با انتقال پروتون‌ها (H+) از طریق غشاء توأم است که منجر به تولید ATP می‌گردد (18). سیتوکروم اکسیداز آخرین کمپلکس آنزیمی در زنجیره انتقال الکترون است که نقش احیاء اکسیژن و اکسیداسیون یوبیکنیون را بر عهده دارد. به علت اینکه الکترونهای منتقل شده در زنجیره انتقال الکترون تک ظرفیتی (singlet) هستند، ایجاد اکسیژن فعال در جریان تنفس سلولی یک فرآیند اجتناب ناپذیر است. از طرف دیگر اتواکسیداسیون بین اکسیژنهای مولکولی و فلاوینها نیز منجر به ایجاد رادیکالهای سوپراکسید و هیدروژن پراکسید می‌گردد (واکنش شماره 2و1)، این واکنشها در خارج از کمپلکس سیتوکروم اکسیداز صورت می‌پذیرند (15). (واکنش شماره 1) (واکنش شماره 2) همچنین هیدروژن پراکسید نیز با یونهای فلزی واکنش داده و باعث ایجاد رادیکالهای هیدروکسیل می‌شود (11). (واکنش شماره 3) رادیکالهای هیدروکسیل بسیار فعال‌تر از اکسیژنهای فعال هستند (2). ترکیباتی نظیر H2O2 ، O2- و OH৹ که دارای اکسیژن فعال هستند (ROS) و در نتیجه تنفس هوازی و متابولیسم ایجاد می‌شوند را اکسیدانت درونزا(endogenus oxidant) می‌نامند (10). اگر سلول قادر به ایجاد تعادل بین میزان تولید ROS (Reactive Oxygen Species) و سم زدایی و حذف ROS نباشد سلول وارد شوک اکسیداتیو می‌گردد. رادیکالهای سوپراکسید موجب تخریب محل قرارگیری فلز در آنزیمهای حاوی فلز و به خصوص آنزیمهای دارای کلاستر آهن می‌گردند و یا با یک مرتبه اکسید کردن فلز باعث غیر فعال کردن آنزیم می‌گردند (6). همچنین ROS در پروتئینهای فاقد فلز با اکسیداسیون گروه تیول و ایجاد پیوندهای دیسولفیدی باعث تخریب و غیر فعال شدن آنها می‌گردد. رادیکالهای هیدروکسیل همچنین باعث شکست DNA دو رشته‌ای نیز می‌شوند (12). از طرف دیگر اتصال فلزات گروههای واسطه به پروتئینهایی نظیر فریتین – ترانسفرین- آلبومین از مکانیزمهای حفاظتی در برابر ROS است (16)، آنتی اکسیدانهایی با وزن مولکولی پایین نظیر آلفاتوکوفرول (ویتامین E) آسکوربیک اسید (ویتامین C) و اسیداوریک از شکست رشته‌ها و تخریب آنها جلوگیری می‌کنند (9). در نهایت باکتری در پاسخ به ROS درونزا (endogenus ROS) اقدام به بیان آنزیمهایی نظیر سوپراکسیددسیموتاز، کاتالاز، آنزیمهای سیستم تیوردکسین، آلکیل هیدروپراکسیدردوکتاز می‌کند که موجب سم زدایی و حذف ROS از محیط می‌گردد. مطالعه حاضر به بررسی تغییر بیان آنزیمهای آنتی اکسیدانت باکتری گرمادوستGH5 (جداسازی شده از چشمه‌های آب گرم اردبیل در شمال غربی ایران)، 8 ساعت پس از شوک سرمایی با استفاده از روش پروتئومیکس می‌پردازد. مواد و روشها مواد: تمامی نوارهای IPG و بافر IPG از شرکت Bio-Rad (از کشور فرانسه) و سایر ترکیبات شیمیایی و معرفها از شرکت سیگما-آلدریچ (از کشور انگلستان) و شرکت مرک (از کشور آلمان) تهیه شدهاند. شرایط کشت باکتری و القای شوک سرمایی: باکتری ترموس GH5 (gi|115521850|gb|DQ973297.1|[115521851] ) از چشمه‌های آب گرم زیست بوم ایران (اردبیل در شمال غربی ایران جداسازی شده و به طور طبیعی قادر به رشد در دمای 75 درجه سانتی گراد می‌باشد. در ابتدا یک تک کلونی از پلیت حاوی باکتری ترموس GH5برداشته و درml50 محیط کشت مایع ترموس و در انکوباتور با دمای 75 درجه سانتی گراد و با تکان rpm200 منتقل گردید. (ترکیبات محیط کشت ترموس عبارتند از ml100 محلول نمکی شماره 1 و ml10 محلول نمکی شماره 2، gr1 تریپتون، gr1 عصاره مخمر، mM FeCl3× 6H2O 17، pH محلول فوق بر روی 8/7 تنظیم شد و به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گراد اتوکلاو گردید. محلول نمکی شماره یک: 1 gr (C6H9NO6),0.6 gr CaSO4 × 2H2O,1 gr MgSO4 × 7H2O, 0.08 gr NaCl, 1.03 gr KNO3,6.89 gr NaNO3, 1.11 gr Na2HPO4, در حجم 1000 میلی لیتر. محلول نمکی شماره دو: 0.22 gr MnSO4 × H2O, 0.05 gr ZnSO4 × 7H2O, 0.05 gr H3BO3,0.0025 gr CuSO4 × 5H2O, 0.0025 gr Na2MoO4 ×2H2O, 0.0046 grCoCl2 × 6H2O در حجم 1000 میلی لیتر) بعد از 16 ساعت و رسیدنOD620 nm به 6/0، یک میلی لیتر از سوسپانسیون سلولی به هر یک از 6 فلاسک 100 میلی لیتری محیط کشت ترموس افزوده شد. فلاسکهای مذکور به دو گروه سه تایی کنترل و شوک سرمایی نامگذاری و در انکوباتور با تکان rpm200 نگهداری شدند و هر 5/1 ساعت یکبار OD فلاسکها توسط اسپکتروفتومتر ثبت شد. پس از رسیدن OD620 nm به حدود 6/0 سه فلاسک گروه کنترل به منظور رسوب گیری باکتریهای محتوی آنها جداسازی و سایر فلاسکها به حمام آب با دمای 45 درجه سانتی گراد با تکان rpm 200 منتقل گردید. فلاسکهای مذکور 8 ساعت بعد از انکوبه شدن در شرایط فوق به منظور رسوب گیری باکتریهای محتوی آنها جداسازی و با دور g 4000 به مدت min 20 و 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. رسوبهای باکتریایی حاصل ازسانتریفیوژ محیطهای کشت سه مرتبه با محلول بافر TEشامل: mM 10 تریس، mM EDTA1/0، mM 1 PMSF وسوکروزmM 250 با 8-7pH: شسته شده و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردیدند. لیز سلولی و تهیه محتوای سلولی: به رسوبات باکتریایی حاصل از مراحل فوق با حجم مساوی تریس mM20، mM PMSF 1/0 افزوده شد و به مدت 5 دقیقه به فاصله 30 ثانیه در دمای 4 درجه سانتی گراد تحت سونیکاسیون قرار گرفتند. به محتوای سلولی حاصل Dnase 70 u/ml و Rnase H 50 u/mlافزوده و به مدت یک ساعت در دمای اتاق نگهداری شد. در نهایت محتوای سلولی حاصل در دمای 4 درجه سانتی گراد با دور g15000 سانتریفیوژ و سوپ رویی جداسازی شد. به محتوای سلولی جداسازی شدهTCA 10 درصد وDTT 1/0 درصد افزوده و به مدت یک شب در 20- درجه سانتی گراد نگهداری شد. سپس در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت نیم ساعت با دور g15000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی که حاوی اسیدهای نوکلئیک، نمکها و سایر ترکیبات ناخواسته بود دور ریخته و رسوب پروتئینهای برای مرحله بعد جداسازی شد. در مرحله بعدی هم حجم یا کمی بیشتر محلول استون سرد حاوی DTT 1/0 درصد به رسوب پروتئینهای افزوده و در دمای 20- درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شد و سپس با دور g15000 به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ گردید. مجدداً به رسوب حاصل هم حجم استون سرد افزوده پیپتاژ کرده، سوسپانسیون ایجاد شده در دمای 20- به مدت 30 دقیقه انکوبه و به دنبال آن به مدت 30 دقیقه به دور g 15000 سانتریفیوژ شد و در نهایت برای آخرین بار به رسوب حاصله هم حجم محلول استون سرد حاوی DTT 1/0 درصد افزوده و پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای 20- درجه سانتی گراد با دور g15000 سانتریفیوژ شد، محلول رویی کاملاً جداسازی شده و به رسوب پروتئینهای لیز بافر افزوده و دوباره حل گردید. محتوای لیز بافر عبارت است از: 7 مولار اوره، 2 مولار تیوره، 4 درصد چپس، 1 درصد IPG buffer pH 3-10 ، 50 میلی مولار DTT. محتوای پروتئینهای نمونه های حاصل شامل نمونههای مربوط به گروه کنترل و شوک سرمایی با روش بردفورد محاسبه شد. الکتروفورز دوبعدی: به منظور باز آبدهی و ایزوالکتروفوکوسینگ برای استریپ 17 سانتیمتری با pH 4-7، mg 5/1 از نمونه را با بافر باز آبدهی (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 1% IPG buffer pH 4-7, 50 mM DTT) به حجم µl 350 رسانده و استریپCm 17 با شیب pH 4-7 در آن خیسانده و پس از 16 ساعت انکوباسیون در دمای اتاق به دستگاه ایزوالکتروفوکوسینگ منتقل شد. پس از اتمام IEF، نوارهای استریپ ابتدا در بافر تعادل 1 شامل: 6 میلی لیتر بافر پایه (تریس 5/1مولار 8/8pH= ، اوره 6 مولار، SDS 2 درصد، گلیسرول 20 درصد، 100 میلی لیتر آب میلی کیو) و 120 میلی گرم DTT و سپس در بافر تعادل 2 شامل: 6 میلی لیتر بافر پایه و 150 میلی گرم یدواستامید، هر کدام به مدت 20 دقیقه قرار گرفت. پس از اتمام مرحله متعادل سازی، نوارهای استریپ بر روی ژل آکریل آمید 15 درصد قرار گرفت. پس از تکمیل الکتروفورز بعد دوم، ژلها تحت رنگ آمیزی با کوماسی بریلیانت بلو G250 قرار گرفتند. از ژلها توسط اسکنرGS-800 Calibrated Densitometer (BioRad, USA) با بالاترین کیفیت و تصویر با فرمت tif و تفکیک پذیری dpi 600 تصویر برداری شد. با استفادهاز تصاویر ژلها و نرم افزارProgenesis PG240طی مراحلSpot detection, Filtering,Editing وMatchingآنالیز ژلها صورت پذیرفت و نرم افزار از نقطه هایی که دچار تغییر بیان شده بودندگزارش تهیه کرد. باتوجه به داده های نرم افزار نقطه هایی باp<0.05 که بیان آنها بیش ازدو برابر کاهش یا افزایش یافتهبود شناسایی و جداسازی شده و برای طیف سنجی جرمی (tandem mass spectroscopy, MALDI TOF/TOF) ارسال شدند. اطلاعات حاصل از PMF و MS/MS به طور خودکار با استفاده از نرم افزار Mascot و اتصال به موتور جستجوی NCBI بررسی و پروتئینها شناسایی شدند. بررسی جرم پپتیدها با استفاده از Mascot و با خطای 2/1 دالتون در وزن مولکولی برای هر یون و 5/0 دالتون برای قطعات یونی انجام شد. نتایج حاصل از طیف سنجی جرمی با کمک پایگاههای اطلاع رسانی EMBL ,GenBank ,DDBJ, Uniport, PIR مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج در ابتدا باکتری به محیطهای کشت مایع ترموس در دو گروه کنترل و شوک سرمایی منتقل و درانکوباتور با دمای 75 درجه سانتی گراد منتقل و هر 5/1 ساعت یکبار OD فلاسکها توسط اسپکتروفتومتر ثبت شد. همچنین پس از شوک سرمایی نیز به طور مرتب میزان جذب فلاسکها ثبت شد و بدین ترتیب نمودار رشد باکتریها در حالت رشد در دمای 75 درجه سانتی گراد و شوک سرمایی (45 درجه سانتی گراد) رسم گردید (شکل 1). شکل 1- نمودار رشد باکتریها در حالت رشد در دمای 75 درجه سانتی گراد (n) و بعد از شوک سرمایی 45 درجه سانتی گراد() محتوای پروتئینهای هر یک از گروههای کنترل و شوک سرمایی (8 ساعت در دمای 45 درجه سانتی گراد) استخراج و تعیین غلظت شدند. نمودار مربوط به متوسط غلظت نمونههای فوق در شکل 2 نمایش داده شده است. با توجه به شکل 2 میزان غلظت پروتئینها و در نتیجه میزان بیان پروتئینها در نمونه شوک زود هنگام نسبت به گروه کنترل کاهش یافته، در حالی که در حالت شوک دیر هنگام (8 ساعت پس از شوک سرمایی) تفاوتی با نمونه کنترل مشاهده نمی‌شود. شکل 2- نمودار مربوط به متوسط غلظت پروتئینها در نمونههای گروههای کنترل (75 درجه سانتی گراد) و شوک سرمایی (h2 و h8 انکوبه در 45 درجه سانتی گراد) برای شروع IEF به منظور افزایش وضوح و جداسازی بهتر پروتئینها از ژل 17 سانتیمتری و pH با شیب غیر خطی 4 تا 7 استفاده شد. شکل 3 ژل الکتروفورز دوبعدی میانگین از نمونههای شوک سرمایی مورد بررسی با استفاده از نوار استریپ 17 سانتیمتری و pH 4-7 با استفاده از رنگآمیزی کوماسی بلو را نشان می‌دهد. شکل 4- تفاوت بیان پروتئینهای (A) ,OSMC (B) تیوردکسین، (C) سوپراکسید دیسموتاز و (D)آلکیلهیدروپراکسیداز در دو گروه کنترل (75 درجه سانتی گراد) و نمونه (45 درجه سانتی گراد). 1 و 2 بترتیب تصویر سه بعدی لکههای پروتئینهای را در دو ژل نمونه (h8) 1 و کنترل 2 نشان می‌دهد. 3و 4 مقایسهلکههایپروتئینهای در دو ژل نمونه (h8)3 و کنترل را به نمایش میگذارد. آنالیز نرمافزاری: بررسی تغییرات رخ داده در بیان پروتئینها توسط نرم افزار PG 240 و با استفاده از تصاویر حاصله از ژلها صورت پذیرفت. نمونههای کنترل و 8 ساعت مورد مقایسه قرار گرفته و مراحل تصفیه (filtering) و ویرایش (editing) لکههای پروتئینهای پس از شناسایی تمامی نقاط پروتئینهای نمایان بر روی ژلها انجام شد (از هر نمونه سه ژل مورد آنالیز قرار گرفت). نقاط شمارهگذاری شده و کاملترین ژلها با بیشترین نقاط پروتئینهای در هر گروه با عنوان ژل مرجع انتخاب شد. پروتئینهای موجود در نمونه با پروتئینهای حاضر در ژل مرجع مطابقت داده شدند. در انتها از ژلهای نمونه و کنترل به طور جداگانه، میانگین گرفته شد، به طوری که کلیه نقاط حاضر در ژلهای نمونه و کنترل به طور میانگین منظور شدند. به طور متوسط 1141 لکه پروتئینهای در ژلهای میانگین گروههای کنترل و 709 لکه پروتئینهای در گروه h8 شناسایی شد. بررسیهای آماری شامل انحراف معیار و t-test (p≤0.05) بر روی داده های مربوط به پس زمینه و مقادیر نرمال (Normal volume) هر نقطه پروتئینهای در ژلهای میانگین انجام گرفت. در مجموع 12 لکه پروتئینهای از میان پروتئینهایی که تغییرات بیانی معنادار داشتند انتخاب و جداسازی شدند که در شکل 3 و جدول 1 گزارش شدهاند. از جمله پروتئینهایی که در این شرایط افزایش بیان نشان دادند می توان سوپراکسیددیسموتاز، تیوردکسین، آلکیلهیدروپراکسیدردکتاز و MOSC را نام برد. این پروتئینها آنتی اکسیدانتهایی هستند که در کنترل شرایط اکسیداتیو نقش دارند. شکل 4 تفاوت بیان این پروتئینها را در دو گروه کنترل (75 درجه سانتی گراد) و نمونه (45 درجه سانتی گراد) نشان می‌دهد. بحث نتایج به دست آمده نشان می‌دهد که با کاهش ناگهانی دما از 75 به 45 درجه سانتی گراد و مواجه شدن باکتری با شوک سرمایی در ساعات اولیه شوک سرمایی، رشد باکتری متوقف می‌شود. اما با گذشت زمان به تدریج بر سرعت رشد باکتری افزوده می‌گردد به طوری که 8 ساعت پس از شوک سرمایی، رشد باکتری سیر صعودی به خود می‌گیر نظرات شما عزیزان:
درباره وبلاگ
  به وبلاگ من خوش آمدید امیدوارم مطالبی رو که در این وبلاگ قرار میدم براتون مفید باشه و از انتخابتون ممنونم...  موضوعات
آرشيو وبلاگ
پیوندهای روزانه
پيوندها
|
|||||||||||||||
 |
|||||||||||||||
خبرنامه وب سایت:
آمار
وب سایت:
